目前，药用抗体的研发主要基于杂交瘤细胞或者体外抗体库。通过抗原设计和抗体筛选，人们初步获得阳性的hits，再进一步通过一系列生物性质检测和功能验证，最终得到有药用潜力的抗体。在实际研发过程中，经过了常规筛选所得的抗体，有诸多方面需要更细致的改进，包括亲和力、免疫原性、半衰期等等，抗体领域这些年来做了很多相关的研究和实践。其中，抗体亲和力成熟是研究的重要方向之一。理论上，抗体亲和力的提高有助于改善抗体的特异性和效力，有助于减少用药剂量，降低毒副作用等。虽然实际的研究工作证明亲和力的提高与抗体效价的提高并不总是线性的关系，尤其在实体瘤的治疗上（可参考Weinstein的“binding site barrier”假说[1]），但很多情况下，这个线性关系是明显存在的。另外，发展抗体亲和力成熟的技术，不仅有助于抗体药物的研发和质量改善，同时也有助于人们更好地理解抗体与靶点相互作用的机理，更好地认识靶点的功能。
本文中，小编就与大家分享自己对抗体亲和力成熟技术的简单总结。本文涉及的技术内容整理如下，之后的行文将围绕这个提纲展开：
1. 模拟体细胞高频突变的抗体亲和力成熟策略
BCR基因重排后的成熟B细胞受到抗原刺激后，会于生发中心发生重链和轻链V区的高频率突变（主要是点突变），之后再经过FDC捕获抗原使表达高亲和力BCR的B细胞免于凋亡。这一过程使得后代B细胞的BCR对抗原的平均亲和力得到提升。这样的体细胞高频突变属于二次免疫应答，帮助可有效识别抗原的抗体进一步成熟，有助于机体有效抵抗外来抗原的再次入侵。
抗体亲和力成熟的策略之一，就是模拟体细胞高频突变，通过细胞突变和展示抗体蛋白筛选对抗原高亲和的抗体。
1.1 基于B细胞系（人、鸡等）高频突变的筛选策略
Ramos是来源于人Burkitt淋巴瘤的一株细胞系，在培养过程中其重排后的免疫球蛋白V区基因持续发生组成型突变，并表达到膜表面。早在2002年Sarah等人就报道了利用Ramos细胞系筛选出对链霉亲和素有高亲和力的IgM[2]。他们将链霉亲和素结合到磁珠上，从一群Ramos细胞中筛出对链霉亲和素有低亲和力的细胞群，之后降低磁珠上的链霉亲和素的密度以提高筛选的苛刻程度，进一步筛出亲和力更高的突变。之后又进一步用标记FITC荧光的链霉亲和素结合流式分选将抗体亲和力进一步提高。
随后，他们对各批次的亚克隆细胞的V区基因做了序列比对，找出了突变位点，分析了抗体与靶点之间的构效关系：
同在这篇文章中，他们还尝试了使用XRCC2缺失的鸡来源的B细胞系（DT40），筛选针对多个抗原的高亲和力IgM。该细胞系同样具有高频率的V区基因组成型突变，并且比Ramos细胞系增殖时间更短。筛选结果显示该细胞系也能实现IgM的亲和力成熟。
以上两个例子说明合适的B细胞系可以作为工具细胞，用于抗体的亲和力成熟。在具体应用中，可以将特定的抗体模板基因插到细胞的免疫球蛋白基因位点，然后进行细胞培养和高亲和力细胞群的筛选。但基于体细胞高频突变的抗体亲和力成熟技术有一定的缺陷，至少包括两点：一是体细胞高频突变过程中每个密码子中通常只有一个碱基发生突变，这严重制约了突变后的库的多样性；二是由于快速的内部化效应，BCR的亲和力往往会遇到天花板（KD值很难达到0.1 nM以下）。
1.2 基于其他细胞高频突变的策略研究
基于体细胞高频突变的抗体亲和力成熟的开发，主流方法均是基于B细胞系。B细胞系有其自身的不足，如基因操作比较困难、蛋白的翻译后修饰特点不能满足所有外源蛋白的要求等等。于是有实验室尝试在非B细胞系统上实现亲和筛选，以扩充该技术的细胞系选择面。如中科院生物物理所杭海英课题组，向人非小细胞肺癌细胞系H1299中导入激活诱导的胞苷脱氨酶（AID），构建H1299-AID稳转株，然后进一步导入抗TNF-α的scFv基因并构建稳转株，得到的稳转株进行培养和流式分选，获取高亲和力的scFv[3]。
除此之外，还有基于非真核系统的筛选方法，如利用E. Coli的基因增变株来实现抗体基因的高频突变等等，其原理大同小异。
2. 基于抗体库的亲和力成熟策略
基于抗体库的抗体亲和力成熟与基于抗体库的抗体筛选并无本质差别，均为体外高亲和力抗体筛选，重点仍是两个方面，即库的构建和筛选系统的选择。区别在于，后者所用的库在构建或合成时无偏向性或只具有针对某抗原的有限的偏向性；而前者所用的库是基于确定的抗体序列模板所构建的。
2.1 建库策略
建库的策略可分为两个大的类别：一类是构建较大的库，将抗体CDR区域甚至整个V区做随机突变；另一类是构建较小的库，将突变集中于抗体序列上特定的区域。
大库构建的方法主要有CDR walking、chain shuffling、DNA shuffling等。CDR walking是指分段随机突变并保证相邻两个突变区域有所重叠，从而使突变覆盖整个CDR区域；chain shuffling是将抗体的VH和VL的配对重新洗牌，而DNA shuffling则是将抗体V区的序列重新洗牌。在DNA shuffling中，突变不限于CDR区，也包括FR区域，因为FR区域对于抗体与抗原的结合也可能有所贡献。这些方法所构建的库的容量较大，工作量也较大。
相比大库的构建，小库构建更有序列针对性。在没有其他信息的情况下，人们习惯优先选择对抗体重链CDR3区域进行随机突变，因为重链CDR3区域被认为通常对抗原抗体结合起关键作用；但若要真正提高亲和力优化的效率，还需要更多的信息以帮助人们找出更精确的突变区域。
目前突变区域的选择主要是基于抗原抗体复合物的结构信息或胚系基因热点（germline hotspots）的预测。
1）基于抗原抗体复合物的结构信息的突变区域选择
当抗体抗原复合物的结构被解析之后，我们就可以得知两者相互作用的位点信息，进而进行更精确的突变和建库。
MorphoSys AG2016年发的文章[4]介绍了他们提高其自身的抗人GM-CSF抗体MOR103的亲和力的工作。他们在知悉该抗体与抗原的结合方式后，对抗体的CDR-H2和CDR-L3分别做随机突变，并用噬菌体展示的方法筛选到高亲和力的序列，之后再把筛到的重链与轻链配对，得到一个新的“cross-cloned”抗体:
体外GM-CSF和GM-CSFR结合的抑制实验比较了这4个抗体的效价。另外，他们还分别解析了这4个抗体与GM-CSF结合的复合物的结构并进行比较，探讨了构效关系。
2）基于胚系基因热点（germline hotspots）的突变区域选择
Germline hotspots是体细胞高频突变过程中的优先突变区域，几乎都处于CDR区域内部，经证明对抗体的亲和力提高起到关键作用，因此体外亲和力成熟时可优先考虑抗体的germline hotspots。
具体的做法是利用数据库来比对抗体的序列和抗体胚系基因序列，结合序列相似度和RGYW motifs等坐标性的序列预测出germline hotspots，然后在这些热点位置进行突变，构建小的库进行筛选。早在2009年，Ira Pastan课题组就发表protocol，以抗CD22的单抗为例，利用germline hotspots预测和噬菌体展示技术提高抗体的亲和力[5]。
至于引入突变的方法，较简单的是易错PCR，但很难达到好的突变效果。另外一种比较流行的就是在引物上设计突变，即人工合成带有突变区域的引物库。具体的设计方法有很多，包括控制突变碱基的数目、控制每个位点各种碱基出现的概率等，以此来满足对库的容量和偏向性的需求。
2.2 筛选方法
基于库的抗体亲和力成熟与基于库的抗体初步筛选涉及的方法基本相同，主要是利用噬菌体展示、酵母展示、核糖体展示等系统。
噬菌体展示的优势在于操作方便，流程相对简易；酵母展示的优势在于与流式分选相结合，检测和筛选同时进行；核糖体展示的优势是系统容量较大，可用于大库的筛选，另外可以实现库的体外进化。这些技术各有优劣，根据实际需要选择使用。
参考文献
Micropharmacology of monoclonal antibodies in solid tumors: direct experimental evidence for a binding sitebarrier. Cancer Research
Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B cell lines. Nature Biotechnology
Affinity maturation ofanti-TNF-alpha scFvwith somatic hypermutation in non-B cells. Protein Cell
Molecular basis of in vitro affinity maturation and functional evolution of a neutralizing anti-human GM-CSF antibody. mAbs
In Vitro Antibody Affinity Maturation Targeting Germline Hotspots. Methods MolBiol
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